El linfoma folicular (LF) es una neoplasia indolente paradigmática de las células B maduras. FL se caracteriza por la t (14:18) y mutaciones en genes modificadores de cromatina. Juntas, estas mutaciones contribuyen a la detención de la maduración de las células B FL malignas en el centro germinal (GC). A pesar de la presencia de estas y otras aberraciones genéticas, el comportamiento clínico del FL varía ampliamente desde la regresión espontánea hasta la falta de progresión a lo largo de los años, la rápida progresión sintomática e incluso la transformación a un linfoma agresivo de células B. Debido a esta variabilidad y la falta de terapias bien toleradas con potencial curativo, muchos pacientes con LF se tratan con expectativa hasta que los síntomas están presentes o son inminentes. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos que gobiernan el comportamiento de LF aborda una importante necesidad clínica insatisfecha y podría conducir al desarrollo de estrategias para prevenir la progresión sintomática de LF.

De acuerdo con la detención del desarrollo en la etapa GC, las células FL B expresan desaminasa inducida por activación (AID). Al desaminar la citosina en residuos de uracilo, la AID inicia continuamente la hipermutación somática en los genes que codifican el receptor de células B (BCR) del clon FL maligno e introduce mutaciones en todo el genoma. Por lo tanto, FL experimenta continuamente una evolución subclonal en el microambiente GC y muestra un alto grado de heterogeneidad intratumoral. Presumimos que distintos mecanismos causan expansión subclonal y / o impulsan una mayor evolución subclonal. Por lo tanto, proponemos estudiar la evolución subclonal de FL mediante análisis avanzados de una sola célula en combinación con la tecnología de secuenciación de próxima generación (NGS) de lectura larga. En un enfoque multidimensional, mostraremos con precisión la red de evolución subclonal de FL en casos individuales basados ??en el mapeo objetivo de la diversificación subclonal de FL BCR. Las variantes somáticas subclonales y los perfiles de expresión génica de células individuales se asignarán a su posición precisa dentro de la evolución de FL. Este enfoque identificará el mecanismo candidato que impulsa la progresión del FL intralesional a un nivel de detalle sin precedentes y facilitará la aplicación de este enfoque a otras neoplasias malignas.

En el biobanco del Departamento de Hematología de LUMC disponemos de suspensiones unicelulares viables criopreservadas de biopsias de FL con consentimiento informado. En un trabajo anterior, establecimos una secuenciación completa, imparcial y paralela masiva de las transcripciones de BCR en la plataforma PacBio NGS. Al desarrollar el algoritmo WILLOW, podemos generar redes evolutivas FL individuales basadas en miles de lecturas BCR individuales basadas en la máxima parsimonia. Finalmente, hemos creado bibliotecas de ADNc y perfiles de expresión génica a escala media a partir de casos de FL seleccionados en la plataforma 10X Genomics. Si bien los datos preliminares indican que los perfiles de expresión génica biológicamente informativos están asociados con la expansión de FL subclonal y la progresión de la evolución subclonal, también identificamos una limitación severa de la tubería 10X para identificar secuencias de BCR de VDJ altamente mutadas.

Dentro de esta propuesta, planeamos aplicar este enfoque a cinco casos de FL seleccionados a gran profundidad. El análisis de bibliotecas de ADNc unicelulares con códigos de barras con amplificación por PCR anidada y la última generación de secuenciación de una sola molécula de longitud completa (plataforma PacBio Sequel II) generará redes individuales de evolución de FL basadas en la combinación de las secuencias subclonales de la cadena pesada y ligera. del BCR combinado. Los perfiles de expresión génica de células individuales se asignarán a la red y se interrogarán para determinar asociaciones estadísticas con la evolución subclonal. Los perfiles de expresión génica significativos se interpretarán por su contribución a la progresión subclonal mediante los algoritmos de Ontología Genética e Ingenio. Para identificar las causas potenciales de estos perfiles diferenciales de expresión génica, agregaremos la tercera dimensión mediante la secuenciación dirigida de diez variantes subclonales y potencialmente oncogénicas seleccionadas ("genómica por transcriptómica") identificadas mediante la secuenciación profunda del exoma completo de la misma biopsia en el PacBio Secuela II. Alternativamente, analizaremos las propiedades de la BCR, p. Ej. la adquisición de motivos de glicosilación ligados a N en sitios de unión a antígenos a través de hipermutación somática, como causas potenciales de distintos perfiles de expresión génica. A través de este enfoque multidimensional unicelular, identificaremos los mecanismos candidatos significativos que impulsan la evolución subclonal del FL y posiblemente la progresión sintomática clínica. Por lo tanto, estos conocimientos permitirán desarrollar una nueva hipótesis comprobable sobre la patogénesis del FL.